RESUMEN AAPP 2 - B
Sujetos -todos de acuerdo con las regulaciones de la universidad de Columbia IACUC-: -Amigo2-Cre; y de su misma camada, Grik4-Cre y AVPR1b-K0 cruzado con Amigo2-cre. Todos
C57B1/6J.
-Para las agresiones: BALB/cJ.
-Invitro fue probado tanto con machos como con hembras y no se observó diferencia por esta variable.-El comportamiento solo con machos.-Fueron seleccionados asignándoles números al azaar y realizando un test de ceguera para la condición experimental.
Variables:
-VI: Estimulación óptica y no estimulación óptica. Tienen niveles, en este caso activación (luz azul), inhibición (amarilla) y control (la reacción si recibe luz).
-VD: agresividad, equilibrio y control motor.
Tecnología utilizada:
Fisiología in vitro, estimulación y fisiología in vivo, implantación de una fibra óptica crónica y optogenética.Valorándose la intensidad de la luz, tasa de disparo, tiempo que es sometido a la varilla giratoria y que tarda en cometer una agresión o comportamiento agresivo. Para todas las operaciones los ratones fueron anestesiados con isoflurane y analgésicos. La craneotomía fue realizada por encima de la región objetivo y la pipeta de cristal se colocó a la profundidad idónea.Todas las coordinadas tienen como referencia los mm del Bregma.Fue realizada una grabación de linea base durante 10 minutos y la droga, aplicada por 15 antes de medir el efecto de la droga por otros 10 minutos. Se utilizó el software Axograph X, el Excel y PRISM para los análisis analíticos. Igor Pro para el análisis de datos, se probó la normalidad de los datos de cada comportamiento para cada condición experimental. Para comparar las diferencias de luz encendida / apagada dentro de los grupos, los datos que no cumplían con el criterio de normalidad se analizaron mediante el rango con signo de Wilcoxon no paramétrico, mientras que los datos distribuidos normalmente se analizaron mediante la prueba t de Student emparejada de dos colas. Finalmente, las comparaciones entre grupos se probaron mediante la prueba t de Student no aparejada de dos colas o la prueba no paramétrica de Wilcoxon-Mann- Whitney. El criterio de significación estadística se estableció en p <0,05.
Resultados:
-Los ratones en experimentos de comportamiento, tras ser habituados a una habitación oscura, se alojaron en un ciclo luz-oscuridad de 12h. Se permitió a los agresores que se recuperaran de las cirugías para después, emparejarlas con una hembra adulta la cual es retirada para que este permanezca en aislamiento. Los residentes fueron evaluados primero para detectar los signos de disfunción motora y luego analizados en el campo abierto con la carilla giratoria ya agresión (los residentes).-Los experimentos con estimulación optogenética, la fuente de luz se conectó a un cable de fibra óptica permitiendo libertad de movimiento y este se unió al implante con un manguito de férula y se dejó que los ratones se aclimataran. Todos los ensayos se realizaron con una iluminación roja tenue. La coordinación sensoriomotora se evaluó con un aparato de varilla giratoria automatizado. Los ratones se colocaron en una varilla giratoria con una rotación constante que luego iba acelerando. El tiempo de caída se calculó desde el comienzo de la aceleración. Hubo dos ensayos consecutivos donde los ratones se asignaron al azar para recibir estimulación óptica durante el primer o segundo ensayo. Esta comenzó comenzó antes del inicio de la aceleración y continuó hasta que el animal cayó.
-Los ensayos de campo abierto se realizaron en un recipiente cuadrado de plástico blanco opaco.
-Los ensayos de residentes-intrusos. Los residentes se conectaron a la fibra óptica y se dejó que aclimataran. Se introdujo un intruso BALB/c en la jaula. Se detenían si un animal resultara herido por un ataque o el residente atacaba durante varios segundos. Estos se sometieron a cinco ensayos de intruso- residente (intruso nuevo para cada ensayo). Los residentes eran retirados si no atacaban. Se estimuló un subconjunto que expresaban clorhodopsina en intervalos. Los ensayos de intrusos-residentes fueron calificados manualmente por un experimentador ciego al genotipo del ratón y las longitudes de onda de estimulación, y anotados usando el software de código abierto BORIS. Se puntuaron los siguientes comportamientos; autoacicalamiento por parte del residente, interacciones sociales, sonajeros de cola, amenaza lateral, persecución del intruso por parte del residente y ataques de mordedura.
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